Type | Mikroskop , optisk instrument |
---|
Dateret | 1595 |
---|
Emoji | } |
---|
Det optiske mikroskop eller det fotoniske mikroskop er et optisk instrument udstyret med et objektiv og et okular, der gør det muligt at forstørre billedet af en lille genstand (som karakteriserer dens optiske styrke) og at adskille detaljerne i dette billede (og dets opløsningskraft ) så det kan observeres af det menneskelige øje. Det bruges i biologi til at observere celler, væv, i petrografi til at genkende klipper, i metallurgi og i metallografi for at undersøge strukturen af et metal eller en legering.
Det bør ikke forveksles med den binokulære forstørrelsesglas, der ikke kræver tynde flade prøver eller reflekterende, og giver mulighed for at observere naturlige dele uden forberedelse ved at forstørre billedet med en lav faktor, men holde stereoskopisk syn befordrende for makroskopisk undersøgelse, der afslører korn, revner, revner osv.
I øjeblikket har de mest kraftfulde optiske mikroskoper en forstørrelse på × 2500.
På grund af begrænsningerne i det synlige lysspektrum tillader optiske mikroskoper med tilstrækkelig forstørrelse observation af celler (men ikke alle cellulære enheder og underenheder), svampe, protozoer, bakterier, men tillader ikke at observere vira.
Det er svært at sige, hvem der opfandt det sammensatte mikroskop. Det siges ofte, at den hollandske optiker Hans Janssen og hans søn Zacharias Janssen fabrikeret den første mikroskop i 1595, men dette kommer fra en erklæring fra Zacharias Janssen selv i midten af det XVII th århundrede . Zacharias Janssen blev født omkring 1570.
En anden favorit som opfinderen af mikroskopet er Galileo . Han udviklede en occhiolino , et mikroskop bestående af en konveks linse og en anden konkav i 1609. Athanasius Kircher beskrev sit mikroskop i 1646, som han brugte til observation af blod.
Kopi af mikroskopet af Van Leeuwenhoek (nl) (1676).
Optisk mikroskop (1751).
Manschettens mikroskop (1760).
Mikroskop af François-Laurent Villette (1765).
Zeiss mikroskop, Jena (1879).
Voigt og Hochgesang model (1890).
En tegning af Francesco Stelluti af tre bier vises på segl fra pave Urban VIII (1623-1644) og passerer til det første offentliggjorte mikroskopibillede. Christian Huygens , en anden hollænder, der er udviklet i slutningen af det XVII th århundrede en simpel dobbelt okular korrigeret kromatisk aberration, hvilket var et stort skridt fremad i udviklingen af mikroskopet. Huygens okularet er stadig lavet i dag, men lider af et ret lille synsfelt og andre mindre problemer. Generelt tilskrives Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) betyder at have tiltrukket sig opmærksomhed biologer på anvendelserne af mikroskopet, selv hvis almindelige forstørrelsesglas allerede var produceret og anvendt i XVI th århundrede . Van Leeuwenhoeks håndlavede mikroskoper var enkle småskalainstrumenter, der indeholdt en enkelt, men stærk linse. Til sammenligning forblev flere linsesystemer vanskelige at udvikle, og det tog ikke mindre end 150 års optisk udvikling, før det sammensatte mikroskop kunne levere billedkvalitet svarende til Van Leeuwenhoeks enkeltmikroskoper. Ikke desto mindre og på trods af mange påstande kan man ikke betragte Antoni Van Leeuwenhoek som opfinderen af det sammensatte mikroskop. Robert Hooke er også en af de første, der bliver gravid.
Det optiske mikroskop er et optisk system med linser , hvis formål er at opnå et forstørret billede af det observerede objekt.
Objektet, der skal observeres, er placeret foran den første optiske gruppe kaldet " objektiv ". Hvis objektet er uden for brændvidden, danner det et omvendt ægte billede af en anden størrelse; billedet er større end objektet, hvis objektet er placeret i en afstand mindre end dobbelt så linsens brændvidde.
Den anden optiske gruppe på observatørens side er okularet : det er placeret, så billedet er i dets brændplan. Således observerer øjet et billede "ved uendeligt" (for en standard observatør), derfor ved at slappe af de muskler, der er ansvarlige for indkvartering , hvilket giver bedre visuel komfort.
Det er et dioptrisk centreret system, delvist sammensat af dubletter for at korrigere nogle af de optiske afvigelser .
I modsætning til andre optiske systemer, der defineres ved deres optiske forstørrelse ( teleskop ) eller deres forstørrelse ( kamera ), er det passende udtryk for mikroskopet dets styrke , forholdet mellem den vinkel, under hvilken objektet ses. Gennem instrumentet, til længden af objektet.
Den mest anvendte belysningsteknik i klassisk wide-field-mikroskopi er Köhler-belysning , som garanterer optimal billedkvalitet.
Fra bund til top:
Okularet kan udskiftes med et fotografisk kamera eller - i tilfælde af videomikroskopi - af et videokamera eller et CCD- kamera for at foretage en digital erhvervelse. Dette gør det muligt at foretage observationen på en videomonitor (tv-skærm) og at lette brugen og behandlingen af billederne (udskrivning, computerbehandling, telemedicin osv.).
Opløsningen af et mikroskop henviser til dets evne til at adskille meget ens detaljer. Uanset den anvendte sensor og linseafvigelser eller mangler er opløsningen af det optiske mikroskop fundamentalt begrænset af diffraktion af lys. Faktisk på grund af diffraktion er billedet af et punkt ikke et punkt, men et punkt (det luftige sted eller mere generelt punktspredningsfunktionen - PSF). Således vil to forskellige, men nærliggende punkter for billeder have to pletter, hvis overlapning kan forhindre, at de to billedpunkter skelnes: detaljerne løses derefter ikke længere.
Ifølge Abbes teori kan (tværgående) opløsningsgrænsen for et mikroskop, dvs. den mindste afstand, hvorunder to tilstødende punkter ikke længere skelnes, udtrykkes simpelthen ved hjælp af belysningsbølgelængden , brydningsindekset ved objektivudgangen og halvdelen vinkel på den maksimalt tilgængelige lyskegle .
hvor NA er produktets eller numeriske blændeåbning . Vi kan derfor øge opløsningen på to måder:
Opløsningsgrænsen for et konventionelt lysmikroskop er ca. 0,2 um . Den transmissionselektronmikroskop vil nå en grænse 100 gange mindre.
Forbedret opløsning i optisk mikroskopiTalrige lysmikroskopiteknikker kan øge opløsningen. Når de overskrider Abbe-grænsen, kaldes de "superopløsning" eller nanoskopier. Disse inkluderer blandt andet:
Når vi bruger et konventionelt mikroskop, bruger vi det i transmission, det vil sige at lyset passerer gennem den observerede prøve. Det er også muligt at arbejde "i refleksion". I dette tilfælde belyses prøven fra samme side som observatøren, enten ovenfra for et opretstående mikroskop og nedenfra i tilfælde af inverterede mikroskoper, der anvendes i metallografi eller krystallografi. Lyset, der produceres af kilden, passerer gennem målet for første gang, ankommer til prøven, reflekteres og passerer igen gennem målet til observation, hvilket kræver flere sæt spejle eller prismer.
Refleksionsmikroskopi undersøger objekter, der er uigennemsigtige eller for tykke til transmission. Til gengæld kan det naturligvis kun give information om overfladen af prøven i tilfælde af observation i hvidt lys; i polariseret lys gør det det muligt at afsløre kornorienteringen af bestanddelene af mineraler eller metaller.
Et klassisk tilfælde er metallografi, hvor vi foretager observationer af metaldele kaldet metallografier på denne måde. Som nævnt ovenfor er mikroskopet ofte inverteret, hvor den del, der skal observeres, placeres på støttepladen (generelt gennemboret med et cirkulært hul).
I modsætning til diaskopisk belysning ( dia - through) gør episkopisk belysning ( epi - on) det muligt at observere objekter, der er uigennemsigtige i farve og give dem en mere "naturlig" gengivelse.
Ideen med en sådan belysning er gammel, da det i 1740 , Descartes inspireret Lieberkuhn som skabt til sine observationer under lup en sølv spejl omkring målet, er fokus i dette spejl målrette præparatet.
Bright-field (eller "bright-field") optisk mikroskopi er den enkleste og ældste af mikroskopiteknikkerne. De anvendte bølgelængder (synligt spektrum) begrænser opløsningskraften i dette mikroskop til 0,2 µm for dem af dem, der har den bedste optik.
Belysning sker ved transmission af hvidt lys, dvs. prøven belyses nedenfra og observeres ovenfra. Begrænsningerne ved denne teknik er hovedsageligt en lav kontrast for de fleste biologiske prøver og en lav opløsning på grund af sløring skabt af materialet uden for fokalplanet. På den anden side er teknikken enkel, og prøven kræver kun minimal forberedelse.
Hvis prøven belyses ovenfra, siges mikroskopet at være et "omvendt mikroskop". Målet placeres derefter under præparatet, og okularrøret retter lysstrålene ud, så okularerne “normalt” er placeret for brugeren.
Det mørke feltmikroskop, der bruger princippet om "mørkt feltmikroskopi", forbedrer kontrasten af gennemsigtige, men ufarvede prøver.
Mørk feltbelysning bruger en nøje justeret lyskilde for at minimere mængden af direkte transmitteret lys og kun indsamle lys spredt af prøven. Det kan dramatisk øge kontrasten, især for gennemsigtige prøver, mens det kræver lidt udstyr og enkel prøveforberedelse. Denne teknik lider imidlertid under lav samlet lysintensitet og påvirkes stadig af opløsningsgrænsen.
Den belysning Rheinberg er en variant af belysningen mørkefelt hvor gennemsigtige farvefiltre indsættes lige før kondensatoren, således at mere eller mindre skrå lysstråler er farvet forskelligt (bunden af billedet kan være blå, medens prøven fremtræder lyst gult). Opløsningsgrænsen er den samme som i mørkt felt. Andre farvekombinationer er mulige, men deres effektivitet er ret varierende.
Mørk feltmikroskopi er især velegnet til friske prøver og tillader mikrocinematografi (f.eks. Af bakterier på farten). Det har ingen interesse i farvede objekter (udtværinger eller farvede sektioner). Det er især nyttigt til:
Brug af skrå belysning (fra siden) giver et billede af tredimensionelt udseende og kan fremhæve aspekter, der ellers er usynlige. Dette er den største fordel. Begrænsningerne er de samme som for lysfeltmikroskopi.
I polariseret lysmikroskopi placeres prøven mellem en polarisator og en analysator for at detektere variationer i lysets polarisering efter passage gennem prøven. Denne teknik er meget nyttig til observation af dobbeltbrydende medier , især inden for mineralogi.
Når visse forbindelser belyses af en lyskilde med høj energi, udsender de derefter lys ved en lavere energi. Dette er fænomenet fluorescens . Fluorescens (eller epifluorescens ) mikroskopi er en teknik, der bruger et optisk mikroskop udstyret med laseremitteren af fotonstråling med en præcis bølgelængde. Denne stråling vil vække et målmolekyle med fluorescerende egenskaber. Det gør det muligt at drage fordel af fænomenet fluorescens og phosphorescens i stedet for eller ud over den klassiske observation ved refleksion (fysisk) eller absorption af naturligt eller kunstigt synligt lys.
Denne metode er af primær betydning i dag inden for biovidenskab takket være især mærkning af cellulære eller vævsstrukturer med fluorescerende molekyler, såsom rhodamin eller fluorescein . Det kan være meget følsomt og endda tillade påvisning af isolerede molekyler. Forskellige strukturer eller kemiske forbindelser kan også påvises samtidigt ved anvendelse af forskellige forbindelser, som vil blive differentieret ved deres fluorescensfarve.
Det totale interne refleksionsfluorescensmikroskop ( TIRF , total intern refleksionsfluorescensmikroskopi ) eller mikroskopisk evanescerende bølge er en bestemt type optisk fluorescensmikroskop for at undersøge en meget tynd skive af en prøve (mindre end 200 nm tykkelse) takket være en bestemt belysningstilstand: total intern refleksion .
Fasekontrast er en meget anvendt teknik, der understreger forskelle i brydningsindeks som en forskel i kontrast. Det blev udviklet af den hollandske fysiker Frederik Zernike i 1930'erne (han blev tildelt Nobelprisen for dette i 1953). Kernen i en celle vil for eksempel virke mørk i det omgivende cytoplasma. Kontrasten er fremragende, men denne teknik kan ikke bruges med tykke genstande. Ofte dannes en glorie omkring små genstande, der kan drukne detaljer ud.
Systemet består af en cirkulær ring i kondensatoren, der producerer en kegle af lys. Denne kegle er overlejret på en ring af samme størrelse i linsen. Hvert mål har en ring af forskellig størrelse, så det er nødvendigt at tilpasse kondensatoren til hver ændring af mål. Ringen i linsen har specielle optiske egenskaber: den reducerer intensiteten af direkte lys, og vigtigere, det skaber en kunstig faseforskel på en kvart bølgelængde, der skaber interferens med det diffuse lys, og som skaber billedets kontrast.
Interferenskontrast (IC, IC for engelsktalende) er en teknik, der gør det muligt at se gennemsigtige objekter ved at øge deres kontrast. Det er i øjeblikket CI ifølge Nomarski, opfundet i 1950'erne, der er den mest udbredte. Denne teknik giver en mere vigtig sammenlignet med fasekontrasten ved at eliminere fænomenet halo, der er specifikt for sidstnævnte. Det har etableret sig i mikroskopi på mange områder i dag.
Det konfokale mikroskop genererer et billede på en helt anden måde end normal lysfeltmikroskopi. Opløsningen er lidt bedre, men det vigtigste er, at det gør det muligt at danne et billede af tværsnit uden at blive forstyrret af lys uden for brændplanet. Det giver derfor et meget klart billede af tredimensionelle objekter. Det konfokale mikroskop anvendes ofte i forbindelse med fluorescensmikroskopi.
Det linsefri mikroskop registrerer diffraktionsmønsteret for en laser ved prøven (princippet om holografi ) og behandler derefter dette mønster ved hjælp af en computer for at generere billedet.
Den observerede prøve skal opfylde visse betingelser:
I biologi er det på forhånd nødvendigt at placere sektionen af væv (eller væsken, der indeholder levende organismer) mellem et dias og et dækglas . Målet skal nærme sig bladet for at fokusere uden, gennem klodsethed, at ødelægge præparatet, der er blevet meget skrøbeligt.
På grund af forberedelsen kræver optisk mikroskopi et stort antal yderligere enheder til det eneste formål med mikroskopisk observation.
Lad os tage sagen om biopsi inden for medicin og biologi ( anatomopatologi ): diagnosen ved mikroskopi af biologiske dele taget af biopsi under en operation pålægger korte tidsfrister. For at forberede objektglasset bruger vi et apparat kaldet kryotom , en slags "skinkeudskæring", anbragt i en kryostat (fryser), der gør det muligt at skære meget tynde skiver af kroppen, som vil blive observeret ved hurtig afkøling og derefter ved at skære det ved hjælp af bladet på en særlig barbermaskine, slibet på en anden glasplademaskine ved hjælp af diamantpastaer. Hvis vi vil arbejde ved stuetemperatur, er tiden længere og kræver dehydrering og udskiftning af vandet fjernet med paraffin (24 timer), så prøven bevarer sin stivhed; derefter er den også farvet af flere stoffer med skiftende handlinger af meget lang varighed.