Den kromatografi i højtryksvæskekromatografi ( HPLC ) - men er mest almindeligt forkortelsen HPLC ( højtryksvæskekromatografi , eller mere sjældent højtryksvæskekromatografi ) fra 1990 - er en teknik til analytisk separation og / eller præparativ af molekyler til stede i en blanding. Dette gør det muligt at tilpasse de sædvanlige kromatografiske metoder (se kolonne) på en højtryksenhed.
Denne form for kromatografi anvendes ofte i biokemi såvel som i analytisk kemi .
P af akronymet stod oprindeligt for Pressure, men da metoden blev forbedret (reduktion af partikler og regulering af den stationære fase) blev P tilskrevet Performance for at markere denne innovation.
Prøven, der skal analyseres, skubbes af en væske (kaldet mobil fase) i en søjle fyldt med en stationær fase med fin partikelstørrelse ("kornene" er meget små). Strømningshastigheden for den mobile fase er høj, hvilket resulterer i en stigning i trykket i systemet. Denne høje strømningshastighed reducerer den nødvendige tid til at adskille komponenterne langs den stationære fase. Den fine partikelstørrelse af den stationære fase tillader bedre adskillelse af komponenterne. Faktisk for det samme volumen af stationær fase øges udvekslingsoverfladen, hvis de "korn", der sammensætter den, har mindre diameter. De opnåede toppe (via en UV-detektor (proteiner absorberer ved 275-280 nm ) forbundet til et integrations- og beregningssystem) er smallere, så opløsningen forbedres (toppe er godt adskilt, så vi let kan se dem. Differentiere), detektionstærsklen er også lavere (smalle og høje toppe er lettere at isolere fra baggrundsstøj end brede og lave toppe). Kombinationen af disse attributter - høj hastighed og opløsning - fører til udtrykket "høj ydeevne".
De mobile faser anvendes, er blandinger af vand og et blandbart organisk opløsningsmiddel (acetonitril, methanol) eller kombinationer af organiske opløsningsmidler (alkoholer, hexan, dichlormethan , etc. ) blandbare med hinanden.
Ofte ændres sammensætningen af den mobile fase under analysen, dette er den såkaldte "gradient" eller "graduerede eluerings" -tilstand (i modsætning til "isokratisk" -tilstand, for hvilken sammensætningen af den mobile fase forbliver den samme selv under adskillelsen).
For eksempel elueres de mest hydrofobe komponenter med en høj koncentration af methanol på en apolær søjle under anvendelse af en vand / methanol-blanding som mobil fase, mens de mere hydrofile komponenter fortrinsvis elueres med en lav koncentration af methanol. Afhængig af arten af den stationære fase og beskaffenheden af de forbindelser, der skal separeres, starter man med en høj koncentration af methanol eller det modsatte. HPLC gælder for alle kromatografiske principper: adsorption , partition , gelfiltrering , ionbytning , affinitet , etc.
Dette er den del, der bruges til at opbevare elueringsmidlet og injicere det under tryk i søjlen. Hun er lavet af:
En pumpe bruges til isokratisk eluering eller flere til gradienteluering .
Rustfrit stål, Teflon , PEEK eller kondenseret silica- rør anvendes til at forbinde pumpen / pumperne med den kromatografiske injektor . Der findes flere typer injektorer:
Der er flere typer detektorer:
Som navnet antyder, fjerner denne komponent gassen (dioxygen), der er til stede i opløsningsmidlet (erne) for at undgå at beskadige prøverne eller den stationære fase. To typer afgassere anvendes i HPLC:
Der er flere typer væskekromatografi. Arten af den stationære fase afhænger af typen af væskekromatografi, som vi ønsker at gøre, såvel som arten og antallet af forbindelser, som vi ønsker at adskille.
I denne kromatografi består den stationære fase af et fast materiale med stor adsorptionskraft, såsom aluminiumoxid, magnesiumsilicater, silicageler. Komponenterne er simpelthen mere eller mindre tilbageholdt på overfladen af den stationære fase ved fysisk adsorption . Det er en teknik, der tager hensyn til komponenternes polaritet .
I denne kromatografi separeres analytterne i henhold til deres affinitet med de stationære og mobile faser. Affinitet afhænger af polariteten af analytterne og faserne. I normal tilstand er den stationære fase polær, i omvendt tilstand er den ikke-polær. Der er to typer partitionskromatografi:
Normal fasechromatografi (NPLC) består i at adskille forskellige analytter i henhold til deres polaritet. Denne adskillelsesteknik stammer fra Tswett's erfaring og hans kromatografiopsætning lavet med plantepigmenter. I årenes løb er sidstnævnte blevet videreudviklet til at adskille stadig mere komplekse blandinger, ændre fasepolariteten og forbedre den analytiske separationsmetode (tilføjelse af en pumpe for at øge systemtrykket og fremskynde eluering, procesautomatisering osv. ). Dette er baseret på de hydrofile interaktioner og tilhørerne af en analyt mod den mobile og stationære fase for at adskille dem i henhold til deres polaritet.
Princip
Normal fasekromatografi (NPLC) er en type kromatografi, der involverer polære interaktioner, i modsætning til omvendt fasechromatografi (RPLC), som involverer hydrofobe interaktioner. Dette er en konkurrencemekanisme mellem tilbageholdelsen af et opløst stof i den stationære fase og elueringen af det opløste stof i den mobile fase, og derfor affiniteterne for hver analyt mod den mobile fase og den stationære fase. Et ikke-polært eller moderat polært opløsningsmiddel ledes derfor gennem søjlen. De mest tilbageholdte opløste stoffer i den stationære fase eluerer sidst, mens de mindre tilbageholdte opløste elueres først. Forskellige typer interaktioner udnyttes såsom brintbroer, dipol-dipolinteraktioner og syre-base-interaktioner.
Stationære faser
De stationære faser, der anvendes til normal fasechromatografi, er polære faser. En fordel ved denne kromatografi er, at det er muligt at modificere interaktionerne, lige så meget mellem analytterne og den stationære fase, som dem med analytterne og den mobile fase og den mobile fase med den stationære fase. Da analyten bevæger sig i henhold til dens affinitet for den mobile fase og den stationære fase, er det muligt at vælge de to faser for at optimere adskillelsen af et komplekst system. Silica kan bruges direkte, da det indeholder silanolgrupper (Si-OH) på overfladen. Afhængig af metoden, der anvendes til syntese af silica, varierer partiklernes specifikke overfladeareal, partiklernes diameter såvel som porernes diameter. Hver type silica har sine egne separationsegenskaber. Typer af silicaer, der indeholder flere frie silanolgrupper (mere sure) eller mindre silanolgrupper, kan også anvendes afhængigt af den ønskede separationsart. Det er også muligt at funktionalisere silica for at variere polariteten eller karakteren af silicaen ved overfladen, samtidig med at dens overflade bliver mere homogen. Afhængigt af den type adskillelse, man ønsker at foretage, skal man vælge mellem tre klasser af funktionaliseret silica i henhold til følgende selektivitetstrekant:
Hvis adskillelsen ikke fungerer med en type silica, vælges en anden type, der er i en anden klasse for at generere den mest drastiske ændring i interaktionerne mellem den stationære fase og analytterne. De funktionaliserede kiseldioxid, der oftest anvendes til normalfasechromatografi, er cyanopropyleret silica, aminopropyleret silica og 1,2-hydroxypropyleret silica (diol). Andre grupper kan også bruges til funktionalisering af silica til mere specifikke anvendelser, men disse er generelt tilstrækkelige. Diol-søjlen er en syrekolonne, aminosøjlen er en forholdsvis basisk søjle, mens cyanosøjlen har moderate dipoldipol-interaktioner.
Mobil fase
De anvendte opløsningsmidler er de samme som dem, der anvendes til andre typer kromatografi. Ideelt set anvendes lavviskøse opløsningsmidler for at tillade en højere eluentstrømningshastighed i søjlen, som har et lavt kogepunkt for at lette genvindingen af analytterne efter eluering. Derudover skal opløsningsmidlet for at udføre kromatografi absolut være mindre polært end analytterne for at undgå direkte eluering af analytterne. Generelt anvendes hexan eller pentan som det ikke-polære basiske opløsningsmiddel (kaldet opløsningsmiddel A). Det er muligt at spille på polariteten af elueringsmidlet ved at variere polariteten af opløsningsmiddel A. På den anden side er det enklere at anvende en binær eluent, da polariteten vil variere afhængigt af mængden af et polært opløsningsmiddel tilsat. Polære opløsningsmidler, også kaldet modificerende opløsningsmidler (opløsningsmiddel B), er almindeligt anvendte chloroform, dichlormethan, ethylacetat, tetrahydrofuran, methyl-tert-butylether (MTBE), diethylether såvel som alkoholer, såsom methanol eller isopropanol.
En anden vigtig faktor med hensyn til den mobile fase er opløsningsmidlets styrke. Da teknikken er baseret på de forskellige interaktioner mellem analytterne, den mobile fase og den stationære fase, er det derfor vigtigt at justere styrken af eluenten, der er defineret af mobilitetsfasens affinitet til den stationære fase. Således vil et opløsningsmiddel, hvis elueringskraft er større end et andet, have en lettere tid til at trække en analyt ind i den mobile fase, da dens interaktioner vil være stærkere med den stationære fase. Der findes ingen absolut skala for opløsningsmiddelstyrke, da den varierer fra kolonne til kolonne. På den anden side gør flere empiriske skalaer det muligt at klassificere opløsningsmidlerne i en rækkefølge svarende til deres opløsningsmiddelstyrke (ɛ 0 ). For en opløsningsmiddelblanding øges opløsningsmiddelstyrken ikke lineært med procentdelen af polært opløsningsmiddel tilsat. På den anden side kan det beregnes ved hjælp af følgende ligning:
Hvor ε AB er styrken af opløsningsmiddelblandingen, er ε A og ε B opløsningsmiddelstyrken for hvert af de rene opløsningsmidler henholdsvis A og B, N B er molfraktionen, og n B er molekylområdet for det modificerende opløsningsmiddel og α er aktivitetskoefficienten, normalt 1 for en moderne analytisk søjle. Når vi ønsker at optimere en adskillelse, er det vigtigt at holde den samme styrke som opløsningsmiddel efter udskiftning af opløsningsmiddel B.
Solvent selektivitet
Selektiviteten af opløsningsmidlet er sættet af syre-base, dipol-dipol og hydrogenbindingsinteraktioner mellem opløsningsmiddelmolekylerne og analytten. Der er en ændring i selektiviteten af opløsningsmidlet, når de molekylære interaktioner mellem den stationære fase, det opløste stof og den mobile fase ændres skarpt med ændringen af opløsningsmidlet. Selektiviteten af opløsningsmidlet er baseret på Snyder Selectivity Triangle, som styrer valget af opløsningsmiddel eller opløsningsmidler, der skal vælges, såvel som den stationære fase for at optimere separationen af analytten. Hver toppunkt i trekanten repræsenterer et kendetegn ved et opløsningsmiddel, enten protonacceptor, protondonor eller har en dipol. Opløsningsmidler klassificeres i trekanten for at kategorisere dem efter de mulige interaktioner mellem opløsningsmidlet og analytten. For pludselig at ændre interaktionerne mellem opløsningsmidlet og analytterne er det tilstrækkeligt at skifte fra et opløsningsmiddel nær en spids i trekanten til et opløsningsmiddel, der er placeret tættere på en anden spids.
Offshoring-effekt (forskydning)
Lokaliseringseffekten er en ikke-ubetydelig effekt i NPLC. Når en polær opløsningsmiddel kan skabe stærke interaktioner (dipol eller brintbro) med de funktionelle grupper på overfladen af silica, siger vi, at det opløste stof "lokaliseres". Faktisk har en opløsningsmiddel en lokaliseringskapacitet, der er givet som en funktion af det effektive område af gruppen på overfladen af silica. Denne overflade kan reduceres ved virkningen af det modificerende opløsningsmiddel, der i konkurrence med de opløste stoffer har stærke interaktioner af samme type. Jo flere interaktioner opløsningsmidlet har med overfladegrupperne, jo mere reduceres tilbageholdelsen af det opløste stof. Opløsningsmidlet kan derfor eluere et opløst stof hurtigere i søjlen, hvis dets interaktioner med den stationære fase er tilstrækkelige til at modvirke det opløste stof; det siges at have en flytningseffekt. Undertiden er delokaliseringseffekten dominerende over surhedsgraden, basiteten eller dipolariteten af et opløsningsmiddel. Det har derfor en væsentlig effekt på tilbageholdelsen af opløste stoffer.
Solvent bivirkninger
En anden type virkning vedrører interaktionerne mellem opløsningsmidlet og det opløste stof. Disse kaldes opløsningsmiddelbivirkninger. Disse virkninger kan i nogle tilfælde forbedre tilbageholdelsen af opløste stoffer, i andre hindrer det. En første type opløsningsmiddelbivirkning er, når opløsningsmidlet interagerer direkte med det opløste stof. Retentionskraften fordeles derfor, og den stationære fase har svært ved at imødegå disse effekter, hvilket medfører et fald i tilbageholdelsen. En anden bivirkning opstår, når koncentrationen af det modificerende opløsningsmiddel er højere i den stationære fase end i den mobile fase. Når det opløste stof interagerer stærkt med det modificerende opløsningsmiddel, er denne effekt gavnlig og øger tilbageholdelsen af det opløste stof. En tredje bivirkning er en sådan kraft mellem modificeringsopløsningsmidlet og den stationære fase, at modificeringsopløsningsmidlet er sterisk forhindret, hvilket reducerer retention, da modificeringsopløsningsmidlet i den mobile fase stadig kan interagere med det opløste stof.
Grundlaget for en omvendt fase er en normal fase, hvori alkylkæder (eller andre afhængigt af den ønskede polaritet) er blevet podet på niveauet af silanolgrupperne ( slutdæksel ). Generelt består den stationære fase hovedsageligt af små silicapartikler, på hvilke kemiske funktioner er blevet podet, ofte af alkylkæder med 8 eller 18 carbonatomer.
Silanol (Si-OH) -funktionerne, der forbliver, genererer parasitiske hydrofile interaktioner, hvilket gør resultaterne ikke-reproducerbare, især for basiske molekyler. For at undgå dette, er overfladen af silica normalt dækket med en methylgruppe funktion og silanol-funktioner ikke længere fri, men i form (Si-O-CH 3 ), er det dette trin som kaldes " end-capping ”. De kemiske funktioner, der anvendes til end-capping kan dog være af meget forskellig art og de sidste generation kolonnerne resistente over for ekstremt pH er generelt endegruppelukket med funktioner tilbyder en større sterisk gen, såsom tert-butyl (Si -OC (CH 3 ) 3 ).
Afhængigt af podningshastigheden opnås en større eller mindre opløsning.
Denne stationære fase kaldes "omvendt" på grund af polær og hydrofil (uden "transplantaterne"), bliver fasen ikke-polær og hydrofob.
Den faste fase er en uopløselig harpiks forsynet med funktionelle grupper, der er i stand til at dissocieres. Disse er normalt ” sulfonsyre ” (SO 3 H) -grupper for kationbyttere og ” kvaternær ammonium ” (N (R) 3 ) til anionbyttere.
Komponenterne adskilles efter deres molekylære størrelse. Den stationære fase består af et porøst materiale (små partikler af silica eller polymerer), molekyler med en diameter større end porerne kan ikke trænge igennem og bibeholdes ikke. Opholdstiden i kolonnen stiger, når analytternes størrelse falder.
Denne kromatografiteknik består af dannelsen af ikke-kovalente bindinger mellem substratets enantiomerer og den chirale kromatografiske absorbent, hvilket giver diastereomere komplekser med forskellige bindingsaffiniteter. Det bruges derfor især til at adskille enantiomerer.
Kvaliteten og varigheden af en adskillelse kan ændre sig med karakteren af den stationære fase og den anvendte mobile fase. Men for den samme type stationær fase og den samme mobile fase kan kvaliteten og varigheden af en adskillelse også ændres ved hjælp af disse to fases geometriske og driftsegenskaber.
hvor er viskositeten af den mobile fase, og Φ er strømningsmodstandsfaktoren, der afhænger af partiklernes form og kvaliteten af fyldningen af den stationære fase.
For søjler, der er godt fyldt med sfæriske eller uregelmæssige partikler, Vérillons empiriske formel
etableret med de sædvanlige enheder, tillader bekvem beregning af et estimat af ΔP som en funktion af strømningshastigheden F i den mobile fase med en usikkerhed på mindre end 25% og i en bred vifte af driftsforhold (2 μm < d p <50 μm , 1 mm < d c <100 mm ) til væske- og superkritisk fasekromatografi.
Bemærk: Darcy's lov er hydraulik, hvad Ohms lov er for elektricitet. Hydraulisk tryk er analogt med elektrisk potentiale, væskestrøm er analog med strømintensitet, hydraulisk permeabilitet er analog med elektrisk ledningsevne, tryk og trykaflastning af en kromatografisk søjle er analoge med henholdsvis belastning og belastning. Afladning af en elektrisk kondensator.
Det observerbare resultat af en HPLC-analyse præsenteres i form af en kurve for signalet, der detekteres som en funktion af tiden: dette er kromatogrammet . Den har flere gaussiske toppe med forskellige egenskaber:
Derfra kan der beregnes flere egenskaber ved søjlen til adskillelse af toppe:
Under alle omstændigheder er den ydelse, der karakteriserer HPLC-teknikken, defineret af opløsningskraften pr. Tidsenhed, hvilket ikke systematisk indebærer anvendelse af det højest mulige tryk.