De ALGEGIFT er metabolitter syntetiseret af cyanobakterier .
De kan klassificeres i henhold til deres kemiske struktur i tre klasser: 1) cykliske peptider , 2) alkaloider og 3) lipopolysaccharider .
Det er også muligt at differentiere dem efter deres mekanismer toksicitet : a) hepatiske toksiner , b) neuro toksiner og c), Dermato toksiner .
Generel molekylær struktur af mikrocystiner
Generel molekylær struktur af nodulariner
Generel molekylær struktur af toksoider
Generel molekylær struktur af saxitoxiner
Generel molekylær struktur af cylindrospermopsiner (det er ikke et neurotoksin, men snarere et cytotoksin)
Generel molekylær struktur af et endotoksin af E. coli O111: B4 (Hep) L-glycerol-D-manno-heptose; (Gal) galactose; (Glc) glucose; (KDO) 2-keto-3-deoxyoctonsyre; (NGa) N-acetyl-galactosamin; (NGc) N-acetylglucosamin.
Aplysiatoxin molekylær struktur
Molekylær struktur af debromoaplysiatoxin
Lyngbiatoxin molekylær struktur
Molekylær struktur af domoesyre
Molekylær struktur af okadinsyre
Dermatotoksiner er kun kendt i et salt havmiljø , hvorimod LPS er komponenter i cellevæggen i alle cyanobakterier.
Flere eksponeringsveje er mulige at komme i kontakt med cyanotoksiner. De vigtigste ruter er indtagelse af forurenet vand og primær kontakt med det samme vand. Indånding af toksiner i aerosoliseret form og forbrug af en organisme, der har bioakkumuleret et toksin, er to andre sandsynlige eksponeringskilder.
Toksikologiske undersøgelser har bestemt akutte, kroniske, kræftfremkaldende og teratogene virkninger for forskellige cyanotoksiner på flere organismer (hovedsageligt mus) og ifølge flere eksponeringsveje.
Nedenstående tabel viser LD 50 værdier hos mus opnået ved intraperitoneal injektion.
Cyanotoksin | LD 50 (ug / kg) |
---|---|
Microcystin-LR | 50 |
Microcystin-LA | 50 |
Microcystin-YR | 70 |
Microcystin-RR | 600 |
(D-Asp3) mikrocystin-LR | 50 til 300 |
(D-Asp3) mikrocystin-RR | 250 |
(Dha7) mikrocystin-LR | 250 |
(6Z-Adda) mikrocystin-LR | > 1200 |
Nodularin | 50 |
Cylindrospermopsin (ren) | 2000 |
Anatoxin-a og homoanatoxin-a | 200 til 250 |
Anatoxin-a (S) | 20 |
Saxitoxin | 10 |
Til sammenligning er akut sonde-toksicitet hos mus mellem 5 og 10 mg / kg legemsvægt for mikrocystin-LR, nodulariner, cylindrospermopsiner og for anatoxin-a. Saxitoxin (STX) udviser typisk lavere værdier, omkring 260 µg / kg hos mus.
Den følgende tabel viser subkroniske toksicitetsværdier hos mus, hvor NOAEL er "No Observed Adverse Effect Level".
Cyanotoksin | NOAEL (ug / kg dag) |
---|---|
Microcystin-LR | 40 (mus, sonde, 13 uger) |
Cylindrospermopsin | 30 (mus, sonde, 11 uger) |
toxoid-a | 98 (mus, sonde, 28 dage) |
Toksicitetstestene for det samme cyanotoksin er vanskelige at sætte i perspektiv, fordi de ikke alle udføres under de samme betingelser (kontaktmetoder, testede organismer, rene ekstrakter vs algeekstrakter). I sidstnævnte tilfælde kunne der være synergistiske og / eller antagonistiske virkninger mellem den undersøgte organisme og alle metabolitter af algeoprindelse i modsætning til den blotte tilstedeværelse af cyanotoksiner. Vi skal derfor være forsigtige med at fortolke resultaterne.
Standarderne som følge af toksikologiske undersøgelser anvendes på drikkevand og aktiviteter, der involverer kontakt med vand. Afhængigt af tilfældet skelner de mellem tærskelkoncentrationerne efter type cyanotoksiner eller cyanobakterier, ud over hvilke der skal træffes forholdsregler og / eller handlinger for at afhjælpe situationen. Værdierne anvendt på cyanotoksiner tager højde for " samlede cyanotoksiner ", dvs. dem, der er i fri form (opløst i vand) og dem, der er placeret inde i cellerne. De udtrykkes i µg / L. Følgende tabel viser de nuværende standarder og standarder, der tilbydes i forskellige lande.
Cyanotoksin | Land / organisation | Værdier (ug / L) |
---|---|---|
Mikrocystiner | Frankrig | 1.0 |
Mikrocystiner | Canada | 1.5 |
Mikrocystiner | HVEM | 1.0 |
Mikrocystiner | Brasilien | 1.0 |
Mikrocystiner | Australien | 1,3 * |
Mikrocystiner | New Zealand | 1,0 og 0,1 ** |
Nodularins # | New Zealand | 1.0 |
Anatoxin-a # | New Zealand | 3.0 |
Anatoxin-a (S) # | New Zealand | 1.0 |
Cylindrospermopsin # | Australien | 1.0 |
Cylindrospermopsin # | New Zealand | 3.0 |
Saxitoksiner # | Brasilien | 3.0 |
Saxitoksiner # | Australien | 3,0 **% |
Saxitoksiner # | New Zealand | 1.0 |
# Foreslåede eller anbefalede værdier
* Værdi, der tager højde for toksiciteten af alle mikrocystiner
** Værdi, der tager hensyn til tumorfremmende virkning
*** Værdi i µg STX-ækvivalent / L
De anvendte værdier til den maksimalt tålelige koncentration af cyanobakterier udtrykkes i celler / ml. De nuværende standarder for den maksimalt tålelige koncentration i drikkevand og i forurenet vand, der anvendes til rekreative formål, og som primær kontakt opstår med, er henholdsvis 2.000 celler / ml og 20.000 celler / ml . Da en celle i gennemsnit indeholder 0,2 pigogram toksiner, svarer en værdi på 2000 celler / ml til 0,4 µg / L totalt toksin, og værdien på 20.000 celler / ml svarer til 4 µg / L af totalt toksin. Disse værdier (celler / ml) er gennemsnit og er kun gyldige, hvis alle cyanobakterier i vandmængden er cyanotoksinproducenter.
De analytiske metoder kan skelnes i screeningsmetoder, der generelt er meget følsomme, men ikke særlig selektive, og bekræftende metoder, som er meget selektive og udviser mærkbar følsomhed.
Blandt screeningsmetoderne er bioassays på forskellige organismer, ELISA (enzymbundet immunosorbentassay) immunologisk metode og forskellige enzymatiske metoder under anvendelse af de biokemiske egenskaber af cyanotoksiner.
Bekræftelsesmetoderne er hovedsageligt varianter af højtydende væskekromatografi kombineret med forskellige påvisningsmetoder, hvoraf den mest effektive er massespektrometri , som i sig selv præsenterer en flerhed af typer analysatorer.
En stor hindring for analysemetoder er prøveforberedelse. Faktisk, bortset fra bioassays, hvor præparatet kun kræver cellelyse for at ekstrahere intracellulære toksiner, er det ofte nødvendigt at slippe af med flere stoffer, der kan skabe interferens og / eller præ-koncentrere molekyler af interesse.
Lyse og ekstraktionCyanotoksiner opløses i den flydende matrix eller ellers fanges der inde i celler. Det er nyttigt, hvis ikke nødvendigt, at adskille prøverne i henhold til den matrix, der indeholder toksinerne. Ved filtrering og centrifugering er det muligt at adskille de faste fraktioner, det vil sige cellerne i cyanobakterier , fra den vandige matrix, der udgør den flydende fraktion.
Forskellige teknikker til lysering af den faste fraktion anvendes, såsom frysetøning, lyofilisering og lydbehandling (også kaldet ultralyd). Andre protokoller bruger en samtidig lyserings- / ekstraktionsprocedure, såsom for eksempel ekstraktion i et kogende opløsningsmiddel og brugen af en mikrobølgeovn , hvilket gør det muligt at udføre en Soxhlet -ekstraktion . Brugen af væskeekstraktion med høj temperatur under tryk anvendes også.
Intet opløsningsmiddel er universelt til ekstraktion af alle cyanotoksiner, fordi deres molekylære strukturer har en variabel hydrofob eller polær karakter . Hertil kommer, at pH af ekstraktionsopløsningen er en parameter, som er lidt forstået i øjeblikket, men som højst sandsynligt påvirker opløseligheden af forbindelserne givet de ioniserbare grupper til stede i de fleste tilfælde.
Følgende tabel viser de mest anvendte opløsningsmidler til ekstraktion af de vigtigste klasser af cyanotoksiner. Bortset fra mikrocystiner er de andre opløsningsmidler ikke valideret og er genstand for forslag. Betingelserne for ekstraktion af mikrocystiner gælder formodentlig for nodulariner, som er strukturelle analoger af mikrocystiner.
Cyanotoksin | Opløsningsmiddel |
---|---|
Mikrocystiner | Vand: methanol (mellem 50 og 75%) |
Toksoider | Let syrnet vand eller vand: methanol |
Cylindrospermopsins | 25% methanol eller 5% eddikesyreopløsning (pH = 3) |
Saxitoksiner | Vand: methanol ** |
Et problem, der er forbundet med ekstraktionen, er co-ekstraktion af et interfererende middel, der genererer en prøve, som hurtigt bliver kompleks. Derudover har de flydende fraktioner, generelt vandige, en meget lav koncentration af opløste cyanotoksiner. Det er derfor nødvendigt at rense molekylerne af interesse, inden de kvantificeres eller koncentreres for at overskride kvantificeringsgrænserne for analyseapparatet.
Begge disse mål kan opnås gennem fastfaseekstraktion, som er den mest anvendte metode. I denne teknik ledes opløsningen gennem en patron fyldt med partikler, og vores analytter af interesse, som er blevet adsorberet på den faste fase, elueres med et passende opløsningsmiddel. Den mest almindelige faste fase er en C 18 podet fase , der effektivt tilbageholder microcystins og nodularins. Denne faste fase er imidlertid ikke særlig selektiv for de andre cyanotoksiner, der er mere polære. For nylig demonstrerede en undersøgelse tilbageholdelsesegenskaberne hos patroner, der bruger sort kulstof i form af grafit . Denne faste fase virker hovedsageligt som en C 18 podet fase , men når de anvendes under visse betingelser, det kan virke som en kationisk ionbytter .
En anden kromatografisk metode til oprensning og præ-koncentration af mikrocystiner bruger principperne for immunaffinitet. Anvendelse af antistoffer Polyklonale eller monoklonale antistoffer tilsat til den faste understøtning kan selektivt bibeholde molekylerne af interesse og elueres senere.
Dyreforsøg har længe været metoden til at detektere blomstringstoksicitet. Disse metoder har åbenbart dårlig selektivitet og følsomhed. Disse tests bruges nu kun til at forstå toksiners virkningsmekanisme og til at forsøge at udlede standarder for maksimalt tolererbare daglige doser.
Biokemiske metoderPåvisning af mikrocystiner og nodulariner kan udføres under anvendelse af deres biokemiske aktivitet, der er relateret til deres toksicitetsmekanisme. Disse molekyler er hæmmere af proteiner af phosphatase- typen (PP1 eller PP2A), der udfører dephosphorylering af intracellulære phosphoproteiner. Dette involverer måling af aktiviteten af en fast mængde phosphataser som en funktion af forskellige koncentrationer af mikrocystiner / nodulariner med en fast mængde substrat. Oprindeligt var det anvendte substrat en 32P radioisotop , men varianter, der bruger et spektrofotometrisk detekterbart substrat, er blevet udviklet for at overvinde problemerne forbundet med brugen af radioaktivt materiale.
En lignende test er anvendelig til påvisning af anatoksin-a (S) gennem sin aktivitet på enzymet acetyl cholinesterase . Denne test er ikke eksklusivt til dette toksin fordi organophosphat pesticider udviser den samme effekt af hæmning. Endelig kan saxitoxiner påvises ved hjælp af deres biologiske aktivitet, hvor de fungerer som en natriumkanalblokker i cellemembranen . Testen udføres ved at inkubere disse neurotoksiner med neuroblast-lignende kræftceller, som demonstrerer den genetiske ekspression af natriumkanaler, og to midler, der fremmer åbningen og processen med natriumretur ud af cellen. Dette maksimerer aktiviteten af disse kanaler og forbedrer testens følsomhed. Efter inkubationsperioden måles cellernes overlevelsesrate ved kolorimetri som en funktion af koncentrationen af saxitoxiner.
Immunologiske metoderDisse metoder er af ELISA- typen, og de er baseret på princippet om genkendelse af strukturelle motiver, der er til stede på et defineret molekyle, af antistoffer . Teknikken er af den direkte konkurrencetype, hvor der er konkurrence om det aktive sted for antistoffet mellem et mikrocystin konjugeret til et enzym ( peroxidase eller alkalisk phosphatase) og et mikrocystin indeholdt i prøven, der skal analyseres; teknikken er indirekte, når mærkningen er på antistoffet. Efter inkubationstiden tilsættes substratet, og koncentrationen af mikrocystiner-enzym bundet til antistofferne vurderes spektrofotometrisk . Stærk farvning indikerer en lav mængde frie mikrocystiner i prøven, og omvendt indebærer en høj koncentration af mikrocystiner.
Disse metoder er udelukkende kromatografiske teknikker kombineret med en række analysatorer, såsom påvisning af UV-synlig stråling, fluorescensemission og registrering af absorptionsspektret med diodearrayer (PDA) samt de forskellige analysatorer, der anvendes i massespektrometri (MS). Kromatografiske teknikker inkluderer varianter af højtydende væskekromatografi (HPLC), gaskromatografi (GC) og kapillærelektroforese (CE). Variationerne i MS kan henføres til ioniseringsteknikkerne for de anvendte analytter og detektorer. Ioniseringsteknikker er elektrospray (ESI), hurtig atombombardement (FAB) og matrixassisteret laserionisations-desorption (MALDI), mens tredobbelt kvadrupol (QqQ) samt flyvetid (TOF) bruges som en analysator.
De omvendte fase HPLC-metoder bruger en hydrofob C 18 stationær fase , som bevarer i faldende orden microcystins og nodularins, toxoider, cylindrospermopsins og saxitoxin. Sidstnævnte er lidt eller ikke tilbageholdt, og et ionparringsmiddel tilsættes ofte for at øge deres retention. Saxitoxiner er bedre adskilt i HPLC i normal fase med en stationær fase bestående af siliciumdioxid og fri amidgruppe .
Strålingsbaserede påvisningsmetoder kræver tilstedeværelsen af kromoforiske grupper på molekylerne. I visse tilfælde er det nødvendigt at udføre en afledning før eller efter søjle for at tilføje en kromoforgruppe til analytten. Dette er tilfældet med saxitoxiner, som detekteres ved fluorescens .
MS-metoderne bruger hovedsageligt ESI som ioniseringsmetode , og påvisningen udføres med den tredobbelte kvadrupol, som er en tandem massespektrometri (MS / MS) metode. Den tredobbelte kvadrupol tillader forskellige tilstande for optagelse af spektre afhængigt af det ønskede fragmenteringsmønster. Vi finder "multiple reaktionsovervågning" (MRM), "forløberiontilstand" og "valgt ionovervågning" (SIM). Dette sæt af metoder gør det muligt at opnå den nødvendige selektivitet til at detektere de strukturelle analoger af de forskellige klasser af cyanotoksiner takket være fragmenteringsmønsteret.
En anden analysemetode bruger et nedbrydningsprodukt af mikrocystiner og nodulariner som følge af oxidation. Dette produkt analyseres ved GC / MS eller HPLC og detekteres ved fluorescens efter udførelse af en derivat efter kolonne. Denne metode blev udviklet på grund af det faktum, at hepatotoksiner i dyrematricer er bundet kovalent til phosphataser, og kun de, der er frie, detekteres. Derfor frigør en oxidationsprocedure med kaliumpermanganat og natriummetaperiodat carboxylsyren MMPB (2-methyl-3-methoxy-4-phenylsmørsyre) fra aminosyren ADDA.
CE-metoder bruger mobiliteten af et ladet molekyle, der udsættes for et elektrisk felt . Da cyanotoksiner er i anionisk eller kationisk form afhængigt af pH-værdien i den vandige matrix, er det muligt at adskille dem ved EC og detektere dem ved UV-vis eller MS. En interessant variation bruger tilsætningen af et overfladeaktivt middel til den vandige matrix, og dette fungerer som en pseudo-stationær fase. Adskillelsen skyldes forskellene i solubilisering af molekylerne inden i micellerne i det overfladeaktive middel og den elektroforetiske mobilitet.
MALDI-TOF spektrometri er i fuld udvikling, fordi det ikke kræver adskillelse af blandingen på forhånd ved HPLC. Derudover tillader denne metode brugen af en meget lille prøve masse, og ligesom den tredobbelte kvadrupol er det muligt at udføre en scanning af de producerede ioner (post source decay PSD), som gør det muligt at detektere fragmenter af interesse. Denne metode forårsager imidlertid betydelig baggrundsstøj afhængigt af den anvendte matrix.
Den følgende tabel viser detektionsgrænserne for flere analysemetoder.
Metode | Cyanotoksiner | Detektionsgrænse |
---|---|---|
bioassays (mus) | Alle | 1 - 200 ug |
HPLC-UV | Individuelle mikrocystiner | 0,02 µg / L |
HPLC-PDA | Individuelle mikrocystiner | 0,02 µg / L |
HPLC-MS | Individuelle mikrocystiner | 0,01 µg / L |
HPLC-fluorescens | Individuelle saxitoxiner | 34 µg / L |
GC-SM | Anatoxin-a | 1 µg / l |
HPLC-MS / MS | Cylindrospermopsin | 0,2 µg / L |
HPLC- MS / MS | Anatoxin-a | 1 µg / l |
Hæmning af fosfataser (radioisotoper) | Samlede mikrocystiner og nodulariner | 0,02 µg / L |
Hæmning af fosfataser (kolorimetri) | Samlede mikrocystiner og nodulariner | 0,1 µg / l |
MMPB (GC-SM) | Samlede mikrocystiner og nodulariner | 10 µg / g fiskelever |
ELISA | Samlede mikrocystiner og nodulariner | 0,05 µg / L |
ELISA | Anatoxin-a | 0,1 µg / l |
ELISA | Cylindrospermopsin | 0,04 µg / L |
ELISA | Saxitoxin | 0,015 µg / L |
Dyrebioassays har fordelen ved at detektere alle cyanotoksiner, men viser meget lidt selektivitet over for cyanobakterieklasser og endnu mindre for at differentiere strukturelle varianter inden for samme klasse. Desuden er tilstedeværelsen af falske positive resultater ikke ubetydelig, og reproducerbarheden af resultaterne er lav. På trods af dette har disse tests muligheden for at detektere alle cyanotoksiner, herunder ukendte cyanotoksiner, som efterfølgende kan undersøges med bekræftelsesmetoder for at bestemme deres struktur.
Kromatografiske metoder viser den største selektivitet og den bedste kvantificering af de forskellige varianter af cyanotoksiner. Strålingsdetektering er mindre effektiv med hensyn til kvantificering i betragtning af den lavere følsomhed og selektivitet sammenlignet med MS. Det er også inden for anvendelsesområdet for MS-procedurer at bestemme den nøjagtige struktur for de nye toksiner. Manglen på certificerede standarder er i øjeblikket den største ulempe ved alle disse teknikker, hvilket betyder, at alle cyanotoksiner ikke opdages. Desuden kræver prøverne forudgående forberedelse, der forbruger tid og genererer en relativt lang responstid.
De immunologiske og biokemiske metoder er attraktive i betragtning af reaktionstidens hurtighed og muligheden for at detektere alle varianter af det undersøgte cyanotoksin. Dette fører dog nødvendigvis til mangel på information om strukturelle varianter, og i tilfælde af ELISA er der en risiko for krydsreaktivitet, der gør det vanskeligt at relatere koncentrationen af detekterede mikrocystiner med den faktiske toksicitet af prøven. Generelt afhænger de anvendte metoder af det mål, der skal nås, og omkostningerne forbundet med analyserne. Således demonstrerer immunologiske og biokemiske metoder en følsomhed, der kan sammenlignes med bekræftende metoder, til en lavere pris og er valgmuligheder til rutineanalyser. Derudover er det tekniske personales kvalifikationer mindre krævende end i tilfælde af bekræftelsesmetoder. Disse bruges hovedsageligt til forskning og udvikling.
Bekræftelsesmetoderne giver mulighed for at etablere multitoksinanalysemetoder, som efter optimering af de analytiske forhold gør det muligt at minimere analyserne og dermed etablere dem som rutinemetoder.
Undersøgelsen af fænomener som bioakkumulering og dens indvirkning på forbruget af inficerede organismer kræver en protokol til ekstraktion af cyanotoksiner integreret i komplekse matricer. En protokol kendt som "matrixdispersion i fast fase" anvender adsorptionsegenskaber for stoffer såsom silica , aluminiumoxid og sand . Således blandes matrixen med adsorbenten i en mørtel, og den resulterende prøve aflejres i en lille kromatografisk søjle, og analytterne elueres selektivt.
Præparatfremstillingsmetoderne er kedelige, især fastfaseekstraktionen, som kan tage op til en dag. For at optimere reaktionstiden for analytterne kan der foretages modifikation af det kromatografiske apparat for automatisk at udføre oprensningen og forkoncentrationen. For at gøre dette skal en belastningssøjle forbindes til den analytiske søjle med et ventilsystem. Derefter elueres den flydende prøve på påfyldningssøjlen under anvendelse af pumper uafhængige af det kromatografiske system, og analytterne adsorberes selektivt deri, mens eluenten og forurenende stoffer kasseres. Dernæst skifter vi ventilerne, så fødekolonnen er nedstrøms for den analytiske kolonne, og vi bruger pumperne i det kromatografiske system til at eluere vores analytter inde i den analytiske kolonne. Dette gør det muligt at reducere den samlede analysetid drastisk, dvs. mindre end en time pr. Prøve. Denne procedure er blevet anvendt med succes til kvantificering af antiinfektionsmidler i spildevand, og det kan tænkes, at det kan fungere meget godt for cyanotoksiner.
En ny metode til ionisering af analytterne kunne drastisk reducere analysetiden, det vil sige den termiske desorption induceret af laserdiode kombineret med kemisk ionisering ved atmosfærisk tryk .
Prøven opløses i et opløsningsmiddel, som derefter placeres i en analyseplade med 96 brønde. Opløsningsmidlet tørres, og den faste prøve går ind i dampfasen under påvirkning af laserbombardement. Derefter ioniseres de neutrale gasformige analytter kemisk ved atmosfærisk tryk. Dette producerer molekylære ioner på mindre end tre sekunder, som efterfølgende analyseres ved massespektrometri i en samlet tid på mindre end ti sekunder. Fordelene ved denne metode ud over den alt for lave analysetid er muligheden for programmering af temperaturstigningsramper såvel som tiden til opretholdelse af denne temperatur for således selektivt at føre analytterne ind i gasfasen. Dette eliminerer behovet for kromatografisk adskillelse før massespektrometri-analyse. Derudover anvendes ingen matrix og opløsningsmiddel, hvilket reducerer tilstedeværelsen af baggrundsstøj. Denne teknologi er blevet anvendt med succes i undersøgelsen af cytochrom P450-hæmning. Det ville derfor være muligt at analysere cyanotoksinerne ved denne metode, forudsat at analytterne fordampes, før de nedbrydes under virkning af varme.