Den Polymerasekædereaktionen ( PCR ) eller polymerasekædereaktion , generelt Sigle PCR (fra engelsk : polymerasekædereaktion ) eller amplifikation nukleinsyretestning (NAT fransk Canada) er en metode biologi molekylær genamplifikation in vitro .
Det gør det muligt at duplikere en kendt DNA- eller RNA- sekvens i stort antal (med en multiplikationsfaktor i størrelsesordenen en milliard) fra en lille mængde (i størrelsesordenen et par pikogram) syre. Nukleotid ( specifik DNA- sekvens ( den amplikon )) og specifikke primere bestående af syntetiske oligonukleotider af tyve til femogtyve nukleotider. Vi kan således for eksempel detektere tilstedeværelsen af HIV eller måle en viral belastning (koncentration af virussen i plasmaet), spor af GMO'er (genetisk modificerede organismer) eller hepatitis B-, C- og D-vira. I
stigende grad brugt i retsmedicin , denne teknik er baseret på en kombination af to faktorer:
Disse elementer gør det muligt at kontrollere den enzymatiske aktivitet takket være temperaturovergange (leveret af en termisk cykler ) gentaget cyklisk (jf. Kædereaktion ).
De første anvendte DNA-polymeraser kom fra en termofil bakterie (resistent over for meget høje temperaturer), for eksempel Thermus aquaticus ( Taq polymerase ) eller endda Pyrococcus furiosus (Pfu-polymerase), Thermococcus litoralis (Vent eller Tli polymerase), Thermus thermophilus (Tth-polymerase) . I dag siges det, at de anvendte enzymer er rekombinante , hvilket forenkler deres produktion betydeligt, og deres egenskaber er blevet vidt modificeret for at gøre dem mere effektive og mere trofaste.
På mindre end ti år har vi lært at lave mere end en milliard eksemplarer på mindre end en time, hvilket pålagde PCR i laboratorier ved at revolutionere molekylærbiologien. Det er imidlertid upålideligt for nogle prøvekilder ( urin , sputum ) muligvis på grund af Taq-polymerasehæmmere .
PCR er en teknologi, der har revolutioneret molekylærbiologien og har etableret sig meget hurtigt i laboratorier. I modsætning hertil måtte PCR i realtid vente på, at en række teknologiske innovationer kom på markedet, før de blev udviklet og betragtes stadig som en ny metode. Antallet af artikler om året, der besvarer nøgleordene " polymerasekædereaktion " (1) og " realtids polymerasekædereaktion " (2) på PubMed- søgemaskinen giver en ret god idé om deres betydning i den videnskabelige verden. Bemærk, at metoden ikke er fri for bias, for eksempel findes nogle artikler til realtids-PCR i 1991 og 1992 (stiplet linje), mens dens princip kun blev beskrevet i 1993. Forskellen (1-2) er repræsentativ for vægten af slutpunkt PCR , som sandsynligvis gradvist vil give plads til realtid.
Denne teknik har udviklet sig meget siden starten. Blandt de mest grundlæggende ændringer finder vi:
Af hensyn til klarheden svarer datoerne til den første offentliggørelse på marken, og kun de første forfattere er citeret, idet de fulde referencer findes i kapitlet "Bibliografi". Dette valg gør det også muligt at begrænse kontroverser som Rosalind Elsie Franklins rolle i opdagelsen af strukturen af DNA-dobbelthelixen.
PCR er en teknik baseret på en gentagelse af temperaturovergangscyklusser. Bortset fra visse metoder (f.eks. Brugen af hydrolysesonder) indeholder hver cyklus tre trin beskrevet nedenfor. Af hensyn til didaktik vil vi i det følgende eksempel overveje en PCR-effektivitet på 100%.
Dette trin udføres generelt ved stuetemperatur. Dobbeltstrenget DNA vedtager sin dobbelte helixkonformation. I dette eksempel vil vi overveje, at der kun er et indledende dobbeltstrenget DNA-molekyle i opløsningen, det farvede område (lyserødt og orange) svarende til vores amplikon. Bemærk: Supplerende DNA'er som følge af omvendt transkription er generelt enkeltstrengede og vil derefter vedtage komplekse tredimensionelle konformationer svarende til RNA'ernes.
Indledende denaturering (1 'på diagrammet)Før de aktuelle PCR-cyklusser startes, udføres et opvarmningstrin (generelt 10 til 15 minutter ved 95 ° C ). Dette trin gør det muligt at: dehybridisere de dobbeltstrengede DNA'er, at bryde de sekundære strukturer, at homogenisere reaktionsmediet ved termisk omrøring, at aktivere "Hot start" -typen polymeraser, at denaturere andre enzymer, der kunne være i opløsningen ( Omvendt transkriptase, Uracil-N-glycosylase).
Denatureringsfase (1 på diagrammet)Dette trin (generelt 0 til 1 minut ved 95 ° C ) gør det muligt at dehybridisere DNA'erne, "løsne" de polymeraser, der stadig ville være bundet til en matrix, og at homogenisere reaktionsmediet.
Hybridisering eller parringsfase af primerne (2 i diagrammet)Dette trin (generelt 2 til 60 sekunder ved 56 - 64 ° C ) tillader sense- og antisense-primere at hybridisere til template-DNA'er takket være en temperatur, der er termodynamisk gunstig for dem. Få af skabelon-DNA-strengene kan hybridisere (binde) med deres komplementære streng, hvilket ville forhindre primerbinding, da primerne er meget kortere og i meget højere koncentration. Eksperimentelt observeres det, at PCR fungerer selv med en hybridiseringsfase med en temperatur nogle få grader højere end den teoretiske Tm for primerne, sandsynligvis fordi de allerede interagerer med polymeraserne, hvilket ville stabilisere deres hybridisering til skabelon-DNA'et.
Primers egenskaberDette trin (generelt 4 til 120 sekunder ved 72 ° C ) tillader polymeraser at syntetisere den komplementære streng af deres skabelon-DNA ved en temperatur, der er optimal for dem. Denne streng er fremstillet af frie dNTP'er til stede i reaktionsmediet. Varigheden af dette trin afhænger normalt af amplikonets længde.
I slutningen af trin 3 har vi derefter to tråde af skabelon-DNA og to tråde (en sense og en antisense) af DNA, der præcist er defineret ved deres 5'-ende.
Cyklus nr . 2De tre faser forløber på samme måde som i cyklus nr . 1 bortset fra at to polymeraser, der har nået slutningen af deres skabelon-DNA, løsnes spontant. I slutningen af fase 3 opnår vi alle de typer DNA, der vil eksistere under PCR, nemlig:
Ditto for cyklus 2. I slutningen af fase 3 observerer vi 1 streng af type A og F, 3 af B og D og 4 af C og E. Vi observerer udseendet af to CE dobbeltstrengede DNA-molekyler, der svarer til til vores amplikon.
Cyklus nr . 4Ditto for cyklus 3. I slutningen af fase 4 observerer vi 1 streng af type A og F, 4 af B og D og 11 af C og E. Vi observerer, at amplikonet bliver majoritetskombinationen.
Cykler nr . 5 og deroverHvis vi havde øget antallet af cyklusser, ville vi have opnået følgende tabel:
cyklusser | ||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ikke | ||
type molekyler | TIL | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
B | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
VS | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
D | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
E | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
F | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
enkelt streng | nummer | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | 65536 | En n til F n |
% amplikon | 0,00 | 0,00 | 25.00 | 50,00 | 68,75 | 81,25 | 89.06 | 93,75 | 96,48 | 98.05 | 98,93 | 99,41 | 99,68 | 99,83 | 99,91 | 99,95 | ||
dobbelt streng | nummer | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | |
% amplikon | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 12.50 | 43,75 | 65,63 | 79,69 | 88,28 | 93,36 | 96,29 | 97,95 | 98,88 | 99,39 | 99,67 | 99,82 | 99,91 |
hvor A n (B n , etc.) er antallet af molekyler af type A (B, etc.) til stede efter n th cyklus.
Ved at analysere denne tabel finder vi, at:
Disse værdier blev opnået startende fra et enkelt indledende molekyle af dobbeltstrenget DNA, men ellers ville hver skabelon have gennemgået den samme proces. Ved en given cyklus afhænger mængden af DNA derfor af det indledende antal matricer. På den anden side er det teoretisk muligt, uanset dens indledende koncentration, at opnå en hvilken som helst størrelse ved at justere antallet af cyklusser. PCR styres derfor teoretisk af lov:
Men PCR er en kompleks enzymatisk reaktion. Produktet er identisk med substratet og kan komme til at hæmme enzymet, men frem for alt kan de sekundære reagenser (primere, dNTP) begynde at mangle. PCR kan derfor kun have en eksponentiel amplifikationslov, så længe skabelon-DNA er den eneste begrænsende faktor . Reaktionen bliver derefter uforudsigelig, og det er så umuligt at være i stand til at sammenligne flere prøver med hinanden uden en mere eller mindre signifikant kvantitativ bias (se artiklen om kvantitativ PCR ). Det er derfor vigtigt at forstå de forskellige faser af PCR-kinetik.
Dette kapitel beskæftiger sig med den målbare kinetik ved en PCR, fordi teknologiske begrænsninger gør de tidlige cyklusser utilgængelige og generelt en stor del af den eksponentielle del. Dens tilsyneladende (målbare) profil vedtager flere forskellige faser, mere eller mindre udviklet i henhold til metodologiske valg.
NB : Udtrykket effektivitet kan have to betydninger ifølge forfatterne:
Konklusionerne fra disse to begreber (som kan udledes direkte af hinanden) er helt identiske; til den følgende diskussion vil vi bevare den første definition, majoritet. Denne PCR-effektivitet er et grundlæggende element, der skal tages i betragtning, når man opnår en kvantitativ måling eller etablerer en multiplex PCR-protokol, men den er generelt ubetydelig for et kvalitativt eller slutpunkt PCR-resultat .
I tilfælde af en perfekt teoretisk cyklus giver hver skabelonstreng en og kun en komplet kopi af amplikonet. Det samlede antal tråde fordobles derfor ved hvert trin, og den teoretiske effektivitet af en PCR-reaktion (betegnet E ) er i dette tilfælde nøjagtigt lig med to. I grafen, der viser resultatet i en semi-logaritmisk benchmark , resulterer dette i, at hældningen på den retlinede del svarer til en ideel progression af log (2) pr. Cyklus (dvs. ca. 3 decibel pr. Cyklus).
Fremkomsten af realtids-PCR fremhævede, at den faktiske reaktionseffektivitet ikke altid var lig med to. Dette betyder, at på alle cykler, der betragtes som kvantitative (areal nr . 6 kinetik) under de aktuelle replikationsbetingelser, kan en streng ikke give en kopi og en enkelt. I det semi-logaritmiske benchmark-plot resulterer dette i en hældning på højre side, der er forskellig fra den forventede hældning og generelt mindre stejl. Den eksperimentelle hældning kan måles, og giver den eksperimentelle værdi af E . Det faktum, at denne del er lige, betyder, at i dette koncentrationsinterval er det gennemsnitlige antal kopier, der produceres af en streng, konstant fra en cyklus til en anden (og især afhænger ikke af koncentrationerne). Men der er ikke i dette tilfælde "en kopi og kun en pr. Streng", men et andet nummer.
Størstedelen af de eksperimentelle protokoller giver en PCR-effektivitet mellem 1,75 og 2. To fænomener er hovedårsagerne og fører til en eksperimentel effektivitet mindre end eller lig med to, fordi de biokemiske reaktioner ikke altid er samlede, nogle replikationer fejler under reel eksperimentel betingelser:
Omvendt kan nogle kilder overveje også være større end to (hvilket antager, at en streng har en betydelig sandsynlighed for at udføre to eller flere synteser i løbet af en cyklus) og vil være acceptabel op til 2.3. Det kan forklares på to måder:
To skoler kolliderer derefter med understøttende eksperimentelle argumenter. Man mener, at denne effektivitet er konstant for hvert amplikon i en given eksperimentel protokol. Den anden mener, at den altid varierer betydeligt, og at den konstant måles igen. Det skal bemærkes, at det er meget vanskeligt at vide, om en variation i en observeret PCR-effektivitet kommer fra selve naturen af denne metode, fra en variation i den eksperimentelle protokol (manglende reproducerbarhed af reagenser eller håndtering) eller en variation i dataene erhvervelse (variationer i fluorescens, forskellige læsningskanaler, bias i den matematiske analyse). Det er også meget vanskeligt at være sikker på, at den anvendte effektivitet (målt i hvert eksperiment eller ej) faktisk er den, der fandt sted i prøven, der skal kalibreres (se kvantitativ PCR ).
Akronymer og navne på engelsk er angivet i parentes.
Multiplex PCR ( multiplex PCR ) er en protokol til amplifikation af mere end et amplikon ad gangen ved anvendelse af mindst tre primer PCR-reaktioner. PCR-produkterne vil derefter kun være konkurrencedygtige for polymerasen, dNTP'erne og eventuelt DNA-markøren. Det er også muligt at amplificere forskellige typer DNA genkendt af det samme par primere, såsom efterligninger. Multiplex PCR kan udføres ved slutpunktet (PCR-produkterne differentieres normalt efter deres størrelse eller tilstedeværelsen af et restriktionssted) eller i realtid (hvert produkt måles med en specifik probe koblet til en fluorofor, hvis spektrumemission er forskellig fra andre). Dens kvalitative anvendelser er adskillige (påvisning af viral stamme, mutationer osv.), Men dens kvantitative aspekt er ikke enstemmigt på trods af stærkt industrielt pres for dette meget lukrative marked.
Meta-PCR er en fremgangsmåde, der gør det muligt at give et syntetisk DNA-molekyle, der omfatter en hvilken som helst kombination af DNA, der kan amplificeres ved PCR i enhver rækkefølge. Det udføres i et enkelt rør og består af to forskellige PCR-trin adskilt af en optøningscyklus for at fjerne resterende polymeraseaktivitet. Meta-PCR kan bruges til at øge kapaciteten af mutationsscanning og scanningsmetoder.
Den indlejrede PCR , PCR-pull eller den indlejrede PCR ( indlejret PCR ) er en PCR i to på hinanden følgende trin med to forskellige primerpar, hvor den anden bindingssekvens er placeret inden i det første amplikon. Denne teknik blev oprindeligt brugt til at reducere risikoen for kontaminering (slutproduktet skulle være i stand til at interagere med to par primere, derfor to niveauer af specificitet). Det bruges nu i vid udstrækning af virologer, der arbejder på RNA-vira, som kan have høj mutabilitet. Det første par primere er designet til at være i stand til at tilslutte de få stabile dele af virusgenomet, det andet til at identificere undertypen. Det giver også en bedre følsomhed for resultatet.
Det er PCR-amplifikation i nærværelse af en lille mængde af en af primerne. Det tillader direkte sekventering af de amplificerede fragmenter. I løbet af de første 20 til 25 cyklusser genereres dobbeltstrenget DNA, indtil den begrænsende primer er opbrugt, og enkeltstrenget DNA produceres i løbet af de sidste 5 til 10 cyklusser. Forholdet mellem anvendte primere er 50 pmol / 1-5 pmol / 100 µL (1-3 pmol enkeltstrenget efter 30 cyklusser).
Termisk asymmetrisk interlaced PCR ( TAIL-PCR eller Thermal asymmetric interlaced PCR ) er en kompleks protokol, der kombinerer principperne for indlejret PCR, asymmetrisk PCR ved Tm af primerne, rækkefølgen af flere typer cyklusser, der favoriserer hybridisering af sådan og sådan en primer og degenererede primere. Målet er at opnå et endeligt amplikon, der er specifikt for en DNA-sekvens, hvor kun den ene ende er almindeligt kendt med henblik på at sekvensere den ukendte del. Denne metode anvendes i vid udstrækning til kromosomgang eller karakterisering af variable sekvenser af immunglobuliner.
Dette er en teknik, der hjælper udviklingen af en ny PCR-protokol. Det kræver termiske cyklister, der er i stand til at sikre forskellige temperaturer for det samme trin til de forskellige prøver. Det bruges hovedsageligt til at optimere hybridiseringstrinet, især i multiplex PCR.
Den semi-kvantitative PCR er baseret på afbrydelsen af PCR i flere cyklusser svarende til den stationære fase (mængden af DNA stiger meget langsomt, da der er lidt skabelon-DNA), den eksponentielle fase (hurtig vækst) og på plateauet (fald i mængden af reagenser). For en prøve er det muligt at estimere den indledende mængde DNA, hvis der er en prøve, hvor mængden af DNA er kendt (standard). Deres amplifikation ved PCR, standsning af reaktionen mellem 20 th og 30 th PCR-cyklus og sammenligne de lysintensiteter af PCR-produkter mærket BET muligt at estimere den oprindelige mængde af DNA. For to prøver er det muligt at sammenligne deres oprindelige DNA-mængde ved at stoppe PCR før PCR-plateauet (<30 cyklusser).
Real-time PCR eller kvantitativ PCRDen realtids-PCR ( Real-time PCR ) er en revolution i anvendelsen af PCR, denne teknik består i at måle den polymeriserede mængde DNA i hver cyklus (realtid) med et fluorescerende mærke . Det tillader ved dets princip at foretage kvantitative målinger (forklarer navnet kvantitativ PCR, qPCR ), men det kræver specielle termiske cyklister . Det bør ikke forveksles med RT-PCR ( Reverse Transcription PCR ), så vi foretrækker navnene kvantitativ PCR eller qPCR . Visse eksperimenter med konkurrencedygtig PCR eller radioaktiv PCR gør det muligt at opnå kvantitative målinger, der kan udnyttes.
Endpoint PCRDen PCR-endepunkt ( endepunkt PCR ) er et begreb, der opstod i opposition til den real-time PCR . Det refererer til alle forsøg på kvantificering fra slutproduktet af en PCR-reaktion.
Den touchdown polymerasekædereaktion ( Touchdown PCR ) er en protokol anvendes til at opformere DNA dårligt repræsenteret og / eller undergår en konkurrence på deres primere ved pseudo-genprodukter. Den består i at have en meget høj hybridiseringstemperatur i de første cyklusser for at sikre høj stringens og derfor specifik amplifikation. Når først sekvensen af interesse bliver flertallet over for sine konkurrenter, sænkes hybridiseringstemperaturen gradvist for at sikre bedre PCR-effektivitet. Effektiviteten er ikke konstant under hele reaktionen, det er hidtil ikke muligt at kunne opnå et kvantitativt resultat uden bias.
Kolonien PCR ( Colony PCR ) er en protokol til amplifikation af en enkel måde til mikroorganism DNA (bakterier, arkæer eller gær) ved direkte inokulering af kolonien i reaktionsblandingen af PCR. I de første faser af denaturering lyseres cellerne, og deres DNA frigives i reaktionsmediet. Det således frigivne DNA kan derefter tjene som en skabelon.
Colony PCR anvendes især til at verificere effektiviteten af en transgenese. Det blev meget brugt under opførelsen af BAC'er i store sekventeringsprogrammer .
Colony PCR anvendes i vid udstrækning i mikrobiologisk forskning for at fylogenetisk karakterisere de undersøgte stammer.
Ep-PCR tillader, at der introduceres fejl i den sekvens, der er kopieret af polymerasen. Denne teknik kan f.eks. Anvendes til at skabe et stort antal mutanter, som derefter vælges (rettet evolution). Den anvendte polymerase (Taq polymerase er naturligvis mindre trofast end konventionelle polymeraser i PCR) og særlige betingelser (høje koncentrationer af MgC 2 eller tilsætning af MnC 2 ) gør det muligt at forøge hastigheden af fejl.
RT-PCR ( omvendt transkription-polymerasekædereaktion ) er en teknik, der kombinerer omvendt transkription (RT) efterfulgt af PCR. Det syntetiserer den komplementære streng af et RNA med deoxyribonukleotider ved anvendelse af en RNA-afhængig DNA-polymerase ( omvendt transkriptase ). Dette cDNA er generelt beregnet til at blive amplificeret ved PCR (cDNA'et er mere stabilt, det giver mere frihed end RNA'erne til de følgende analyser).
Nyttighed: det bruges til klinisk diagnose via kvantitative målinger ved hjælp af realtids-PCR (undersøgelse af viral belastning i RNA-vira) og via kvalitative målinger (analyse af produktet af genekspression). Det kan også lette sekventeringen af store gener.
Omvendt transkription forbliver delikat (lav reproducerbarhed; skrøbelighed af RNA, hyppig kontaminering med DNA. En specifik amplifikation er undertiden nødvendig (hvis mediet indeholder homologe sekvenser i mængder, der er meget større end de af sekvensen af interesse). Valget af PCR-primere og overholdelse af interne eller eksterne standarder er ofte af stor betydning.
Et-trins RT-PCRRT-PCR trin a ( enkelt trin RT-PCR ) er en protokol, der blander reaktanterne RT og PCR, så begge trin kan udføres uden at skulle åbne røret. Dette gør det muligt at reducere risikoen for kontaminering eller prøveinversion, men det er sværere at optimere reaktionsmediet til hvert trin. Dette medfører yderligere en risiko for bias for at normalisere RT-trinnet, fordi det involverer anvendelse af multiplex PCR.
RT-PCR in situRT-PCR in situ er en metode, der består i at udføre RT-PCR ikke på molekyler i opløsning, men på histologiske sektioner. Selvom resultaterne kun er halvkvantitative, giver de også oplysninger om placeringen af udskrifterne i vævet.
Kvantitativ RT-PCRDen kvantitative RT-PCR (qRT-PCR) er en teknik til at kunne kvantificere en type RNA, der oprindeligt var til stede i en prøve. Dette udtryk betegner brugen af to teknikker i rækkefølge, omvendt transkription efterfulgt af PCR i realtid. Hovedformålet for de fleste biologer, det rejser livlige kontroverser med hensyn til brugen af ekstern eller intern kalibrator (husholdningsgen). Med undtagelse af komplekse protokoller, der bruger konkurrerende homologe eksterne kalibratorer, tillader det kun relativ kvantificering.
RT-PCR på en celleSingle-cell RT-PCR ( single-cell RT-PCR ) er en metode, der anvendes til at studere transkripterne af en enkelt celle, opnået ved patch-clamp, laser mikrodissektion eller cellesortering ved fluorescensaktivitet (FACS på engelsk for fluorescensaktiveret cellesortering ). Denne præcision kan være nødvendig, når vævet ikke er homogent (tumorceller, godt differentierede cellelag osv.), Men kvantificeringen bliver mindre præcis på grund af en forstærkning af de stokastiske effekter og kræver derfor en multiplikation af målingerne.
En anden isoterm amplifikationsteknik: "polymerisering af nukleinsyrer til kontrolleret apoptose". Forfatterne hævder, at denne teknik kunne implementeres i levende celler og dermed behandle forskellige patologier (HIV, malaria, kræft osv.), Men disse påstande er ikke blevet bekræftet af noget andet hold i øjeblikket.
TP-PCR (TP står for Triplet Repeat primed ), en kompleks variant af PCR, blev udviklet af Jon Warner i 1996 og bruges i amplifikationer af gener med gentagne tripletter, som i tilfældet med myotonisk dystrofi. Af Steinert . PCR- sekventeringskombinationen kan ikke bruges i disse tilfælde, fordi Taq-polymerasen laver replikationsfejl.
Den helikaseafhængige amplifikation ( helicase-afhængig amplifikation , HDA ) er en ny teknik tæt på PCR, hvor temperaturinduceret dehybridisering tilvejebringes af en helicase.
PCR muliggør hurtig og meget specifik diagnose af infektionssygdomme forårsaget af bakterier eller vira. PCR tillader også identifikation af ikke-dyrkbare eller langsomt voksende mikroorganismer, såsom mycobakterier , anaerobe bakterier eller vira fra vævskulturassays og dyremodeller. Grundlaget for PCR-diagnostiske anvendelser inden for mikrobiologi er påvisning af infektiøse agenser og diskrimination af ikke-patogene stammer fra patogene stammer på basis af specifikke gener.
Karakteriseringen og påvisningen af infektiøse organismer er blevet revolutioneret af PCR som følger:
Den humane immundefektvirus (eller HIV ) er et vanskeligt mål at finde og udrydde. De første tests for infektion var baseret på tilstedeværelsen af antistoffer mod virussen i blodbanen. Antistoffer vises dog først flere uger efter infektion, moderantistoffer maskerer infektion hos en nyfødt, og terapeutiske midler til bekæmpelse af infektionen påvirker ikke antistofferne. PCR-test er udviklet til at være i stand til at detektere lave virale belastninger i størrelsesordenen af et viralt genom blandt DNA'et på mere end 50.000 værtsceller. Infektioner kan påvises tidligere, doneret blod kan screenes direkte for virussen, nyfødte kan straks testes for infektion, og virkningerne af antivirale behandlinger kan kvantificeres.
Nogle patogene organismer, såsom tuberkulose , er vanskelige at indsamle fra patienter og udvikler sig langsomt i laboratoriet. PCR-baserede tests kan påvise et lille antal patogene organismer (levende eller døde) i prøver. Detaljeret genetisk analyse kan også bruges til at detektere antibiotikaresistens, hvilket muliggør øjeblikkelig og effektiv behandling. Virkningerne af antibiotikabehandling kan også straks vurderes.
Spredningen af en patogen organisme gennem populationer af husdyr eller vilde dyr kan overvåges ved PCR-test. I mange tilfælde kan udseendet af nye virulente undertyper detekteres og overvåges. Subtyperne af en organisme, der var ansvarlige for tidligere udbrud, kan også bestemmes af PCR.
Virus-DNA kan påvises ved PCR. De anvendte primere skal være specifikke for målsekvenserne i DNA'et af en virus, og PCR kan anvendes til diagnostiske assays eller DNA-sekventering af det virale genom. PCR's høje følsomhed muliggør påvisning af virussen kort efter infektion og endda før sygdomssymptomerne opstod. En sådan tidlig påvisning kan give lægerne et bredere udvalg af behandling. Mængden af virus ( viral belastning ) hos en patient kan også kvantificeres ved hjælp af DNA-kvantificeringsteknikker baseret på PCR. For eksempel anvendes en variant af PCR (RT-PCR) til at detektere virusgenomet af Coronavirus sygdom 2019 .
Sygdomme som kighoste er forårsaget af bakterien Bordetella pertussis. Denne bakterie forårsager en alvorlig akut luftvejsinfektion, der påvirker forskellige dyr og mennesker og resulterer i mange små børns død. Pertussis-toksin er et protein exotoxin , der binder til celle receptorer ved to dimerer og reagerer med forskellige celletyper, såsom T-lymfocytter, som spiller en rolle i cellulær immunitet. PCR er et vigtigt testværktøj, der kan detektere sekvenser i pertussis-toksingenet. Da PCR har høj toksinfølsomhed og hurtig behandlingstid, er det meget effektivt til diagnosticering af kighoste sammenlignet med kultur.